La iglesia de Santa María de la Asunción se alza en el punto más elevado de Dueñas, dominando la villa desde finales del siglo XII. Su arquitectura, a caballo entre el románico y el gótico, responde a una planta de tres naves, con transepto poco acusado y una cabecera formada por un ábside central poligonal y otro semicircular, mientras que el del lado de la epístola fue sustituido por la sacristía en el siglo XVIII.
Las naves, cubiertas con bóvedas de crucería y de arista, se elevan sobre pilares octogonales mediante arcos apuntados. Sobre el crucero se alza un cimborrio exterior que alberga una cúpula barroca, iluminada por óculos y rematada en linterna. La torre, situada a los pies del templo, se concluyó en 1589 siguiendo los planos de Alonso de Tolosa.
En su interior destaca el extraordinario retablo mayor, realizado entre 1510 y 1518 por Antonio de Malinas, Giralte de Bruselas, Pedro Manso y Alonso de Ampudia. Considerado una obra maestra del gótico final castellano, representa escenas de la vida de la Virgen y de Cristo.
En la capilla mayor se conservan los sepulcros de los condes de Buendía, de los siglos XV y XVI, y resulta especialmente singular la sillería, donde se combinan tracerías góticas con motivos de salvajes, posiblemente vinculados a los nuevos descubrimientos geográficos.
El templo alberga además un notable conjunto de obras artísticas, entre las que destacan un Crucifijo y una urna sepulcral góticos del siglo XIII; el retablo de San Ildefonso, síntesis del arte flamenco y el primer Renacimiento; esculturas de Gregorio Fernández, como San Isidro Labrador, y piezas barrocas de la escuela madrileña.
Como reflejo de la concepción del mundo en la Edad Moderna, en la capilla bautismal se conserva el Itinerario místico, del siglo XVII, una representación simbólica del universo y del camino hacia el cielo. El órgano, fechado en 1754, y el retablo moderno de la Virgen de la O, patrona de Dueñas, completan este destacado conjunto.
La iglesia cuenta además con un pequeño museo parroquial donde se conserva valiosa platería donada por los Acuña y un excepcional Ecce Homo de Diego de Siloé.
